Forschungsgebiete
Molekulare Mechanismen der nicht-genotropen Aldosteronwirkung
Aldosteron spielt eine wichtige Rolle bei der Regulation von Salz- und Wasserhaushalt sowie bei pathologischen kardiovaskulären und renalen Veränderungen. Wie für andere Steroide wurden für Aldosteron Effekte beschrieben, die nicht auf einem direkten genomischen Mechanismus beruhen. Es liegt also ein dualer Wirkmechanismus vor: genomisch und nicht-genotrop. Wie auch von uns gezeigt, werden nicht-genotrope Effekte teilweise durch den klassischen humanen Mineralokortikoid-Rezeptor (hMR) vermittelt und hängen vom „Crosstalk“ mit dem Epidermal Growth Factor-Rezeptor (EGFR) ab. hMR benutzt EGFR als heterologes Signaltransduktionssystem. Wir wollen die Rolle der verschiedenen Domänen des klassischen hMR bezüglich nicht-genotroper Wirkungen auf molekularer Ebene charakterisieren sowie deren Interaktion mit EGF-Rezeptoren untersuchen. Weiterhin werden wir die transkriptionelle Bedeutung nicht-genotroper Signale mit geeigneten Konstrukten testen sowie die Beeinflussung der genomischen Wirkung durch Signale des nicht-genotropen Weges untersuchen. Zu diesem Zweck verwenden wir heterologe Expressionssysteme mit geeigneten hMR-Konstrukten und humanen EGF-Rezeptoren.
Aldosteron-induzierte Expression des EGF-Rezeptors
Aldosteron führt am Herzen, an Gefäßen sowie an der Niere zu pathologischen Gewebe-veränderungen, wie Fibrose und Entzündung. Diese Rolle wird durch die klinische RALES-Studie unterstützt, die zeigt, dass Aldosteronantagonisten die Mortalitätsrate bei Herzinsuffizienz senken. Die beteiligten Vorgänge sind unklar. Somit besteht Handlungs-bedarf bezüglich Aufklärung der Mechanismen dieser pathologischen Aldosteronwirkung. Da wachstumsfaktor- und zytokintypische Signalwege wahrscheinlich eine Rolle spielen, stellt die Wechselwirkung von Aldosteron mit dem epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) einen attraktiven Erklärungsansatz dar: (i) EGF fördert proliferative und fibrotische Veränderungen an kardiovaskulärem und renalem Gewebe. (ii) Bei Tieren mit mineralokortikoidinduzierter Hypertonie findet sich eine erhöhte vaskuläre EGF-Empfindlichkeit. (iii) Literaturdaten und unsere Vorversuche zeigen, dass Aldosteron die Expression des EGF-Rezeptors (EGFR) stimulieren kann. Diese Befunde stehen im Einklang mit oben genannter Hypothese und können zur Erklärung der pathologischen Wirkung von Aldosteron beitragen. In unserem Projekt sollen Mechanismen und Konsequenzen der mineralokortikoidrezeptorinduzierten EGFR-Expression untersucht werden.
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Renokardiovaskuläre Erkrankungen zählen zu den häufigsten Todesursachen. Funktionelle Störungen der arteriellen Gefäßwand sind initiale Schlüsselereignisse bei Erkrankungen des Herzens, der Niere und auch des zentralen Nervensystems. Veränderungen der Gefäßwand betreffen neben der Einstellung des Gefäßtonus auch die Wandstruktur und deren adaptive Umwandlung bei pathophysiologischen Belastungen. Funktion und Morphologie von Gefäßen unterliegen der Kontrolle durch zahlreiche humorale und lokale Faktoren, die untereinander in Wechselwirkung stehende intrazelluläre Signalkaskaden beeinflussen, wobei das integrierte Ergebnis letztendlich die Veränderung der zellulären Funktion bestimmt. Die Aufklärung dieser Signalprozesse kann zu einem besseren Verständnis der Vorgänge innerhalb von Gefäßen führen und somit einen Beitrag zur Aufklärung möglicher Ursachen renokardiovaskulärer Erkrankungen leisten.
Im Rahmen dieses Projektes wird die Bedeutung des EGF-Rezeptors (EGFR) in Gefäßmuskelzellen unter physiologischen Bedingungen sowie bei pathologischen Regulations- und Adaptationsmechanismen des renokardiovaskulären Systems untersucht, da sich gezeigt hat, dass der EGFR eine Schlüsselposition innerhalb relevanter Signalkaskaden einnimmt. Es ist bekannt, dass der EGFR auch als Relaisstation für heterologe Signaltransduktion dient. In dieser Funktion wird der EGFR durch Signale aktiviert, die keine direkten Liganden für ihn darstellen, wie z.B. die Homone Angiotensin II, Aldosteron, Endothelin und deren Rezeptoren sowie Sauerstoffradikale oder mechanische Faktoren. Diese Transaktivierung ist wahrscheinlich essentiell für die Wirkung dieser Hormone im Rahmen eines überschießenden Wachstums von Gefäßzellen, deren Migration, Störungen der Bindegewebshomöostase aber auch der Gefäßfunktion per se. Dies bedeutet, dass physiologische und pathophysiologische Effekte im renokardiovaskulären System der EGFR-Transaktivierung bedürfen. Weiterhin gibt es Hinweise, dass der EGFR unter bestimmten Voraussetzungen protektive Wirkung im kardiovaskulären System entfaltet. Kontext-abhängig kann der EGFR somit im Sinne einer Janusköpfigkeit positiv oder negativ wirken.
Da die Beteiligung des EGFR an pathologischen Prozessen durch v.a. pharmakologische Studien ex vivo und in Zellkultur belegt ist, wurden für dieses Projekt zwei Mausmodelle mit Gefäßmuskelzell-spezifischer Deletion etabliert und partiell bereits charakterisiert (konstitutive Deletion und induzierbare Deletion). Mit dem Projekt sollen folgende Ziele erreicht werden: (i) Charakterisierung des Phänotyps der Tiere zur Beschreibung der zellspezifischen physiologischen Rolle des EGFR. (ii) Untersuchung der schädigenden Wirkungen vasoaktiver Substanzen (u.a. Angiotensin II und Aldosteron) in Abhängigkeit von der EGFR-Expression. Zu diesen Zwecken werden Studien auf drei Ebenen durchgeführt: (a) in vivo, (b) an isolierten Aortenringen und (c) an Gefäßmuskelzellen in Primärkultur. Die zu untersuchenden Zielparameter umfassen hämodynamische und renale Größen, Expression relevanter Gene, Gefäßmechanik, Phänotyp glatter Gefäßmuskelzellen, Wirkung vasoaktiver Substanzen sowie die Signaltransduktion über den EGFR im Sinne der Transaktivierung. Dadurch ist die Beurteilung der Rolle des glattmuskulären EGFR für die Gefäßhomöostase an sich sowie im Rahmen der Entstehung vaskulärer Schäden zellbiologisch und in vivo möglich.
Steroid hormone receptors are ligand-dependent transcription factors that control a variety of homeostatic functions, starting from salt metabolism to sexual behavior. It is now evident that steroid hormone receptors do not follow a simple on/off switch model, but depend on the interaction with different signaling networks. Although for some steroid hormone receptors information is available, for the mineralocorticoid receptor (MR) very little is known. The MR controls extracellular volume, long-term regulation of blood pressure and homeostatic behavior. MR also promotes renocardiovascular inflammation and fibrosis independently of blood pressure and salt homeostasis. As a ligand-dependent transcription factor, MR modulates the expression of proteins. Furthermore, MR interacts non-genomically with cytosolic signaling pathways, including calcium and protein kinases in different cell types. Its closest relative, the glucocorticoid receptor (GR), is important for e.g. development, glucose/lipid metabolism and immune function. Although the cellular and systemic effects of MR-activation are clearly distinct from GR-activation, the mechanism of their differential action is not understood. So far no mineralocorticoid-response element has been identified in promoters and most genes induced by MR are also induced by GR.
Control of miRNA expression by MR would offer an additional level of regulation which has not been investigated until today. This function could contribute to differential effects compared with its closest relative glucocorticoid receptors. In recent years the importance of altered miRNA expression for the renocardiovascular system has been shown and gains rapid growing consideration. Thus, our project is of basic and clinical relevance.
Der Phänotyp von Tumorzellen hängt - neben seiner genetischen Determiniertheit - zum Teil vom umgebenden und zum Teil von selbst kreierten Milieu ab. Die „seed and soil“-Hypothese geht sogar soweit, dass nach Erwerb aller kanzerösen genetischen Veränderungen erst die Änderung des Mikromilieus das Wachstum der Tumorzellen ermöglicht. Thema dieses Teilvorhabens ist die Charakterisierung von Milieu-Signal-Interaktionen an Tumorzellen als Grundlage für Weiterentwicklung rationaler, patientenindividualisierter Therapiestrategien in der Onkologie. Hierbei sollen relevante Proteinmodifikationen des Milieu-Signal-Dialoges identifiziert und als therapeutische Zielstruktur validiert werden. Der Fokus liegt dabei auf der Bedeutung des pH-Wertes im Mikromilieu und dessen Einfluss auf Proteinkinasen. Die Arbeiten befassen sich mit der molekularen Charakterisierung von Azidose-induzierten Signalwegen, der ablaufenden Modifikationen von Signalmodulen, deren funktionelle Relevanz für den Tumorphänotyp und dadurch die Identifikation neuer Therapiestrategien homöostatischer (Modifikation des Mikromilieus) oder funktioneller (Beeinflussung von Zielproteinen) Art. Ausgehend von den in diesem Vorhaben erarbeiteten Mechanismen und charakterisierten Schlüsselmolekülen soll die Wirkstoffweiterentwicklung unterstützt werden, so dass möglichst großer Nutzen bei möglichst geringen unerwünschten Wirkungen entsteht.
A lot of substances have nephrotoxic side effects and act as cell stressors as e.g. chemotherapeutica (cisplatin, metabolites of ifosfamide) or mycotoxins. Ochratoxin A (OTA) is a ubiquitous mycotoxin produced by some species of Aspergillus and Penicillium genus acting primarily on the kidney. It is detectable in human blood in low concentration due to normal diet. OTA is frequently supposed to be the causing agent of Balkan endemic nephropathy and of porcine nephropathy. The mechanism of the cell damaging action of these cell stressors often remains largely unknown.
Subject of our studies is:
- Altered gene expression in human renal cells induced by OTA
- Posttranscriptional regulation influenced by OTA and other cell stressors
- Transformation of epithelial cells by OTA and other nephrotoxins
- Cell death induced by OTA and other nephrotoxins (cisplatin, fumonisins)
- Transport of OTA across epithelia of the nephron and its uptake into cells studied on MDCK cells.
- Effects of OTA on carrier systems of cells of the proximal tubule (OK cells).
- Interaction of OTA with chloride channels and cellular pH-homeostasis
- Impairment of renal hemodynamics by OTA
- Impairment of proximal tubular function by OTA
- Impairment of the renal concentrating mechanism by OTA
- Impairment of urine acidification by OTA
- Interaction of OTA and other nephrotoxins with intracellular signaling pathways
- Cytotoxicity of ifosfamide and its metabolites chloroacetaldeyhde and acrolein on renal cells
- Interaction of ifosfamide and its metabolites with intracellular signaling
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Kardiologisch-intensivmedizinisch relevante Erkrankungen, wie infarktbedingter kardiogener Schock, Sepsis, Multiorganversagen oder Herzinsuffizienz sind durch systemische Inflammationsprozesse charakterisiert. Wie im Vorantrag (SCHM 1398/2-1,-2) gezeigt werden konnte, ist diese systemische Entzündungsreaktion eng mit der Entwicklung einer prognostisch ungünstigen Reduktion der Herzfrequenzvariabilität (HRV) bei gleichzeitig inadäquatem Herzfrequenzanstieg assoziiert. Die hierfür verantwortlichen Mechanismen sind bisher jedoch nicht genau bekannt. Wir konnten unlängst allerdings zeigen, dass bakterielles Endotoxin konzentrationsabhängig den Schrittmacherstrom If im menschlichen Vorhofgewebe hemmt und somit einen kausalen Erklärungsansatz für die genannten Phänomene darstellen könnte.
Mit dem jetzt beantragten Forschungsprojekt soll zum einen der Mechanismus der Endotoxin-induzierten Hemmung des kardialen Schrittmacherstroms If, dessen HCN-Isoform-Spezifität und der resultierende Einfluss auf Herzfrequenz und HRV analysiert werden. Darauf aufbauend kann dann untersucht werden, inwiefern sich im Rahmen des infarktbedingten kardiogenen Schocks und im Sepsismodell das kardiale Expressionsmuster der HCN-Isoformen ändert, und ob dies möglicherweise zu den genannten negativen Effekten im Herzen beiträgt.
Damit können wesentliche Beiträge zur Aufklärung der Mechanismen der prognostisch bedeutsamen autonomen Dysfunktion geleistet und neue therapeutische Ansatzpunkte zur Modulation dieses Phänomens aufgezeigt werden.
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Transportphysiologie und –pathophysiologie
Viele wichtige Medikamente (z.B. Antibiotika, Zytostatika, Zyklooxygenasehemmer) und endogene Substrate wie Prostaglandine, Urat und Oxalat sind organische Anionen. Das renale Sekretionsssystem für organische Anionen ist im proximalen Tubulus lokalisiert. Der geschwindigkeitsbestimmende Schritt ist die basolaterale Aufnahme organischer Anionen. Die Aktivität dieses renalen Sekretionssystems entscheidet über Konzentration und Verweildauer organischer Anionen im Organismus, sie ist also mitentscheidend für Wirkung oder Toxizität dieser Substanzen. Bisher sind noch keine konkreten Signalwege bekannt, die den renalen organischen Anionentransport auf Expressionsebene regulieren.
Durch Studien an Ratten konnten wir zeigen, (i) dass nach renaler Ischämie die Sekretion organischer Anionen reversibel gehemmt ist. (ii) Das gilt auch für die Expression der Proteine, welche den geschwindigkeitsbestimmenden, basolateralen Schritt der Sekretion vermitteln. (iii) Diese Ergebnisse konnten wir an einem in vitro-Ischämie-Modell an proximalen Tubuluszellen der Ratte reproduzieren. (iiii) Studien am Ischämie-Modell mit Zyklooxygenasehemmern und Prostaglandin E2 legen eine Beteiligung von Prostaglandin E2 an der durch Ischämie induzierten Expressionshemmung nahe.
Daraus ergibt sich eine attraktive Hypothese zum Mechanismus der durch Ischämie induzierten Hemmung der renalen Sekretion organischer Anionen: Ischämie induziert die Bildung von Prostaglandin E2, welches zur Expressionshemmung der basolateralen Transportproteine für organische Anionen führt. In unserem Projekt sollen die Mechanismen der durch Ischämie induzierten Expressionshemmung der basolateralen Transportproteine für organische Anionen untersucht werden. Dabei sollen erstmals konkrete Signalwege beschrieben werden, die die renale Sekretion organischer Anionen regulieren.
Einfluss des metabolischen Mikromilieus solider Tumoren auf die Aktivität von Medikamententransportern: Bedeutung für die Chemosensibilität von Tumoren in vivo.
Sowohl experimentelle als auch humane Tumoren zeigen im Vergleich zu Normalgeweben ein deutlich verändertes metabolisches Mikromilieu. So lässt sich in über 50% der klinischen Tumoren ein ausgeprägter O2-Mangel (Hypoxie) nachweisen. Um trotzdem eine ausreichende Energieversorgung sicher zu stellen, forciert die Tumorzelle den anaeroben Stoffwechselweg, wobei Glukose direkt zu Milchsäure umgesetzt wird, sodass sich in vielen Tumoren ein ausgeprägter Glukosemangel, eine Laktatzunahme sowie eine starke extrazelluläre Azidose (pH<6,8) nachweisen lässt. Auf der anderen Seite ist seit längerer Zeit bekannt, dass die Tumorhypoxie die Wirksamkeit verschiedener Chemotherapeutika einschränkt. So benötigen einige Pharmaka molekularen Sauerstoff, um ihre zytotoxische Wirksamkeit zu entfalten (z.B. Alkylatien). Jedoch müssen auch indirekte Effekte des O2-Mangels berücksichtigt werden, wie beispielsweise eine Beeinflussung der Pharmakokinetik durch die extrazelluläre Azidose.
Auf der anderen Seite verfügen viele Tumorzellen über aktive Transportmechanismen, die Pharmaka unter direktem ATP-Verbrauch aus der Zelle transportieren können (ABC-Transporter), deren wichtigste Vertreter das p-Glykoprotein (pGP, Produkt des MDR1-Gens) sowie das Multidrug-resistance associated protein 1 (MRP1) sind. Da zahlreiche solide wachsende Tumoren diese Transporter exprimieren, werden sie für ein vermindertes Ansprechen dieser Malignome gegenüber verschiedenen Chemotherapeutika verantwortlich gemacht. Andererseits könnte die Hemmung dieser Medikamententransporter zu einer Steigerung der zytotoxischen Wirksamkeit verschiedener Chemotherapeutika führen. Die Aktivität dieser ABC-Transporter kann durch verschiedene Zytokine, Onkogene oder Tumorsupressorgene beeinflusst werden, wobei sowohl die Expression der Transporter als auch deren funktionelle Transportleistung einer Modulation zu unterliegen scheinen. Über eine Beeinflussung der Transporter-Aktivität durch das metabolische Mikromilieu (Hypoxie, Azidose, Hypoglykämie) ist bisher nur sehr wenig bekannt. Eigene Vorarbeiten deuten jedoch darauf hin, dass metabolische Veränderungen im Tumor zu einer Steigerung der Pumpenaktivität und somit zu einer erhöhten Resistenz gegenüber verschiedenen Chemotherapeutika führen. Die zugrunde liegenden Mechanismen sind bisher jedoch nicht bekannt.
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Hypoxia-induced extracellular acidosis increases p-glycoprotein activity and chemoresistance in tumors in vivo via p38 signaling pathway.
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Physiologie und Pathophysiologie der Proteinendozytose in renalen proximalen Tubuluszellen
In der Niere werden Proteine des Blutplasmas unter physiologischen Bedingungen nur eingeschränkt glomerulär filtriert. Diese filtrierten Proteine werden anschließend im proximalen Tubulus des Nephrons durch Rezeptor-vermittelte Endozytose resorbiert. Durch diese Resorption wird zum einen der Verlust von Aminosäuren, zum anderen jedoch auch der Verlust von anderen wertvollen Substanzen, wie Vitamine, verhindert. Außerdem ist diese Endozytose dafür verantwortlich, dass (i) die Vitamin-D-Vorstufe zur endgültigen Aktivierung in die proximalen Tubuluszellen gelangt und (ii), dass die Oberflächenexpression von Membranproteinen adäquat reguliert wird. Der größte Teil der Endozytose wird durch den Rezeptorkomplex Megalin/Cubilin vermittelt. Der geschilderten Endozytose kommt eine dreifache pathophysiologische Bedeutung zu: Verminderte Endozytose führt zum Verlust von Aminosäuren und Vitaminen; bei vermehrtem Proteinangebot führt die vermehrte Proteinendozytose zu pathologischen - sowohl fibrotischen als auch entzündlichen - Veränderungen des Nierengewebes; veränderte Endozytoseraten können zu pathologisch veränderter Oberflächenexpression von Membranproteinen führen. Das Ziel unseres Projektes ist es, (a) die Mechanismen der physiologischen und pathophysiologischen Regulation der Endozytose besser zu verstehen und (b) die zellulären Vorgänge im Rahmen der proteininduzierten Veränderungen sowie deren Modulierbarkeit genauer zu charakterisieren. Die erhobenen Befunde sollen auch langfristig dazu beitragen Therapiekonzepte im Rahmen von interstitiellen Nierenerkrankungen zu entwickeln.
Entwicklung von Therapiestrategien zur Verhinderung proteinurieinduzierter interstitieller Nierenschäden
Fortschreitende interstitielle Fibrose (bindegewebiger Umbau) der Niere ist bei vielen Erkrankungen für die Entwicklung eines chronischen Nierenversagens (ca. 10.000 Neuerkranungen/Jahr in Deutschland) entscheidend. Dieses führt zu lebensbedrohlichen Veränderungen des Salz-, Wasser-, Vitamin- und Hormonhaushaltes sowie der Entgiftungsfunktion, wodurch eine Nierenersatztherapie (Dialyse, Transplantation) notwendig wird. Das Fortschreiten der Fibrose wird ganz wesentlich durch die Wechselwirkung bestimmter Zellen der Nierenkanälchen (proximale Tubuli) mit filtrierten Proteinen bestimmt. Diese Zellen üben bei vermehrter Proteinfiltration eine profibrotische und proinflammatorische Wirkung aus. Die Rolle der Proteinaufnahme in diese proximalen Tubuluszellen sowie der anschließend ablaufenden Signalvorgänge für die Entwicklung der Fibrose ist größtenteils noch nicht bekannt. Ziel unseres Vorhabens ist die genaue Charakterisierung der Bedeutung von Proteinaufnahme und der verantwortlichen Signalvorgänge im Rahmen der Fibroseentwicklung und das Austesten daraus abgeleiteter Therapiestrategien. Unsere Ergebnisse sollen zur Entwicklung von Therapiekonzepten bei interstitiellen Nierenerkrankungen beitragen.
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Chronic interstitial deregulation of tissue homeostasis (parainflammation) is a risk factor for fibrosis and carcinogenesis. The mechanisms of unbalanced tissue homeostasis involve altered transcriptional and post-transcriptional regulatory mechanisms, including non-coding RNAs such as microRNAs (miR) or long non-coding RNAs (lncRNAs). LncRNAs belong to a rapidly growing class of RNAs and are defined as non-coding transcripts longer than 200 nucleotides. They are involved in processes like chromatin modification, transcriptional and post-transcriptional gene regulation. For example, lncRNAs have been shown to sequester miRNAs and thereby promote the expression of miRNA-target genes (sponge-like action). Wnt1-inducible signaling pathway protein 1 (WISP1) is involved in organ development but also in fibrogenic and cancerous tissue alterations. It belongs to the CCN family of connective tissue growth factors and is canonically regulated by the Wnt1/β-catenin pathway. Also, some splice variants and other alternative transcripts expressed from the WISP1 locus with mostly unknown function have been described. Some of these appear to act as non-coding RNAs. Our recent data showed that an alternative WISP1 transcript is upregulated by different cell stressors in renal cells leading to the increased formation of extracellular matrix (ECM) components such as collagens. This suggests a role of the WISP1 locus in pathological cellular processes, in particular fibrosis. Accordingly, the identification and characterization of triggers and mechanisms involved in WISP1 RNA-induced deregulation of tissue homeostasis may contribute to the understanding of organ and tissue remodeling and malfunction. These studies have to address: 1) relevant cell stressors; 2) signaling pathways involved in non-coding RNA expression; 3) interactions of non-coding RNAs and their crosstalk with target gene expression.